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實時熒光定量PCR技術原理與優點

提供者:上海遠慕生物科技有限公司   發布時間:2021/11/4 10:08:08  閱讀次數:72次   進入該公司店鋪

實時熒光定量PCR(Real time PCR)是在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實現了實時監測整個PCR進程,并對起始模板進行定量分析的方法。其涉及域包括:臨床疾病診斷、動物檢驗檢疫、食品安全和科學研究等。在xin型guan狀病毒、肝炎、艾zi病、流感、登革熱、感染性腹瀉等的檢測、診斷和治療上發揮著重要作用。

實時熒光定量PCR法可分別為SYBR Green l熒光染料法和Taqman探針法。日常進行核酸檢測就是運用Taqman探針法,新guan病毒核酸檢測也是利用此項技術。該法高度特異,其核心是利用Taq酶的3’→5’外切核酸酶活性,切斷探針,產生熒光信號。

在Taqman探針法的定量PCR反應體系中,包括一對PCR引物和一條探針。探針的5’端標記有報告基團(Reporter,R),如FAM、VIC等,3’端標記有熒光淬滅基團(Quencher,Q),如TAMRA等。當探針完整時,報告基團所發射的熒光被淬滅基團吸收,儀器不能檢測信號。隨著PCR反應的進行,Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針,其3’→5’外切核酸酶活性被探針切斷,報告基團遠離淬滅基團,能量不能被吸收,就產生熒光信號。因此每經過一個循環,熒光信號就和目的片段一樣有一個同步指數增長過程。

這里涉及基線和CT值的概念。基線是用來確定背景的熒光信號強度的參比對照,相當于PCR指數擴增期以的熒光強度水平。CT值是PCR擴增過程中,熒光信號開始由本底指數增長階段的拐點所對應的循環次數,其由擴增反應體系中模板的初始濃度決定。

與傳統PCR相比,實時熒光定量PCR有著以下優點:

1.檢測結果既可以定性,也可以定量;

2.檢測靈敏度高;
 

3.無需進行凝膠電泳實驗,節省實驗時間,提高了效率。

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圖1 Taqman探針法工作原理

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圖2 實時熒光定量PCR的幾個主要參數


 

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